PCR抑制物對退伍軍人菌定量分析之影響(POD)

　　即時定量聚合？連鎖反應 (real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time qPCR) 為具高特異性且可快速、大量定量的分析方法，為目前退伍軍人菌檢測主要之發展方向。冷卻水塔為退伍軍人菌重要滋生源，但水塔中累積許多有機物與鐵質，這些均可能抑制real-time qPCR反應，若未能去除抑制物干擾，則可能低估real-time qPCR檢測結果。本研究比較QiAamp DNA mini kit (Q) 與freeze-thaw/phenol-chloroform (FT-PC) 兩種DNA萃取方法，以及此兩種方法加上膠體管柱 (Sepharose 4B gel column, G) 純化對PCR抑制物的移除、分離的DNA純度及DNA產量之影響；另亦評估Q、Q/G、FT-PC及FT-PC/G結合稀釋作用後所得real-time qPCR抑制情形以及其相對應之L. pneumophila濃度。結果發現：(i) 對腐植酸與鐵離子共存樣本，以Q及FT-PC均可去除≦100 μg/mL腐植酸至低於偵測下限 (1 μg/mL)；(ii) 而不論鐵離子單獨或與腐植酸共存的樣本，Q均可得獲得最高DNA產量 (2.53~3.36; 6.58~6.79 μg/mL)，其次為FT-PC (2.00~2.37; 3.90~4.33 μg/mL)，Q/G (1.15~1.27; 3.21~3.33 μg/mL) 及FT-PC/G (0.76~0.80; 1.77~1.85 μg/mL)；(iii) 四種方法均可獲得純度佳的DNA (A260/A280=1.5-2.0)；(iv) 以G純化DNA無法進一步改善PCR抑制情形，而稀釋作用則可有效去除以Q、Q/G以及FT-PC/G所得DNA之PCR抑制情形。及 (v) 比較四種處理方法結合不同稀釋倍數於real-time qPCR檢測L. pneumophila濃度之結果發現：只含鐵離子的樣本以Q萃取加上10倍或100倍的稀釋可得最接近起使添加之細菌濃度值；而鐵離子與腐植酸共存之樣本，最佳之處理程序則為Q或Q/G分離DNA再加上10倍或100倍的稀釋。由於Q/G程序較複雜且會造成部分DNA損失，因此本研究建議以Q萃取法加上10倍或100倍稀釋為以real-time qPCR檢測含有鐵離子單獨或與腐植酸共存水樣中L. pneumophila之最佳DNA處理程序。